Western blot 웨스턴 블롯 단백질 면역 블롯
웨스턴 블롯이란?
특정 단백질을 주어진 샘플에서 감지하는 분자 생물학 기술입니다.
단백질을 분리하고 검출하는 실험 기술로, 단백질을 전기영동과 면역반응을 이용하여 분리하고 특정 단백질을 찾아내는 것입니다.
웨스턴 블롯의 과정?
분리
- 먼저, 샘플 내의 단백질을 끓는 물에 몇 분 동안 가열하여 변성시킵니다. 이 과정에서 단백질 복합체가 분해되고, 모든 개별 단백질이 펼쳐집니다. 변성 단계에서는 각 단백질을 음전하로 코팅하는 역할도 수행합니다.
- 열 변성된 단백질은 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 방법을 사용하여 분리됩니다.
- 변성된 단백질을 폴리아크릴아마이드 젤 상단의 웰에 로드합니다. 젤 내부에는 단백질이 통과할 수 있는 작은 구멍과 공간이 마련되어 있습니다.
- 젤에 전류를 흘려 단백질이 젤의 바닥 쪽으로 이동하도록 합니다. 이때 단백질이 모두 음전하를 띠고 있기 때문에, 젤 상단의 음전하에 의해 밀려나고 젤 하단의 양전하에 끌려 내려갑니다. 이러한 방식으로 단백질은 크기에 따라 폴리아크릴아마이드 젤 내에서 서로 다른 위치에 분리됩니다.
전이
분리가 완료되면, SDS-PAGE에서 분리된 단백질을 전기 블로팅 방법을 통해 PVDF(Polyvinylidene Fluoride) 멤브레인으로 전이합니다.
젤과 멤브레인을 밀착시키기 위해 필터 페이퍼와 필터 패드를 사용하며, 버퍼 솔루션으로 코팅하여 접촉을 유지합니다.
전체 세트를 전기장이 형성된 버퍼로 채워진 탱크에 넣습니다.
단백질은 탱크 내 양극에 끌려 젤을 빠져나와 멤브레인으로 이동해 전이됩니다.
차단
다음 단계는 항체를 사용해 원하는 단백질을 검출하는 것입니다.
하지만 항체가 멤브레인에 비특이적으로 결합할 수 있기 때문에, 이를 방지하기 위해 묽은 BSA 또는 스킴 밀크를 묽은 세제와 함께 사용하여 멤브레인을 차단(blocking)합니다.
이 차단 단백질은 단백질 밴드가 존재하는 영역을 제외한 멤브레인의 다른 부분과 결합하여 비특이적 결합을 방지합니다.
검출
멤브레인이 차단된 후, 특정 단백질에 결합하는 1차 항체(primary antibody)로 멤브레인을 처리합니다.
1차 항체의 결합을 시각화하기 위해 2차 항체(secondary antibody)를 사용하며, 이 2차 항체에는 검출 가능한 유색 생성물로 변환되는 리포터 효소가 부착되어 있습니다.
따라서 스케너를 사용해 멤브레인을 분석하여 우리가 원하는 단백질에 대한 정보를 얻을 수 있습니다.
웨스턴 블롯의 장단점?
장점
- 특이성: 특정 항체를 사용하여 원하는 단백질만 검출할 수 있어, 다른 기법들에 비해 높은 특이성을 가집니다.
- 정량성: 단백질의 양을 측정할 수 있어, 상대적인 표현 수준을 비교하는 데 유용합니다.
이는 적절한 표준화와 적절한 대조군을 사용함으로써 향상될 수 있습니다.
- 다양한 적용 가능성: 웨스턴 블롯은 다양한 샘플 유형(세포, 조직, 체액 등)에서 사용할 수 있어,
넓은 범위의 연구에서 적용 가능합니다.
- 단백질 분자량 추정: 전기영동 과정을 통해 단백질의 분자량을 추정할 수 있어,
단백질의 구조적 변화나 변형을 감지하는 데 도움이 됩니다.
단점
- 시간 소모적: 웨스턴 블롯은 여러 단계로 이루어져 있으며, 각 단계에 시간이 소요되므로
상대적으로 시간이 오래 걸립니다.
- 높은 비용: 항체, 전기영동 장비, 멤브레인 등에 필요한 물품들의 비용이 높을 수 있습니다.
- 기술적 난이도: 웨스턴 블롯은 기술적으로 정교한 실험으로, 정확한 결과를 얻기 위해서는
많은 경험과 노하우가 필요합니다.
- 변동성: 실험 조건의 작은 변화가 결과에 영향을 줄 수 있어, 신뢰성 있는 결과를 얻기 위해
정교한 표준화가 요구됩니다.
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[출처: https://blog.naver.com/remi2007/223109121506}
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